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类器官培养秘籍 | 操作流程之人肝脏类器官

肝脏是负责药物代谢和解毒的主要器官系统。因此,其极易受到药物及其他化学毒物的损害。模拟肝脏代谢的动物模型和传统体外分析往往无法再现患者体内的药物毒理过程。来源于原代组织或诱导多能干细胞的肝脏类器官已成为一种更复杂、更具预测性的模型,适用于肝毒性检测和药物筛选。


本方案以人胎来源的肝脏类器官为例,提供了人肝脏细胞分离及类器官培养、传代的步骤 [1,2],仅供参考。


材料(人肝脏类器官培养所需的材料)

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工具或设备

1)   剪刀,镊子(钝头)

2)   培养皿

3)   细胞培养箱(37°C、5% CO2

4)   层流超净工作台

5)   带有制冷功能和摇摆吊桶式转子的离心机

6) 37°C 水浴

7)   冰桶

8)   实验室冰箱

9)   助吸器和血清移液管(5 mL)

10)   微量移液器及吸头(2-200 μL)

11)   锥形管,10 mL 和 50 mL,无菌

12) 24 孔板,经过组织培养处理,无菌

13)   真空泵

14)   培养基过滤装置,0.1 μm,500 mL,无菌

15)   注射器,50 mL,无菌

16)   针头过滤器,0.2 μm,无菌

17)   细胞培养废液缸


其它必需的试剂

1)   蒸馏水(DW)或去离子水(DI)

2)   磷酸盐缓冲液(PBS)


试剂准备

在本方案的操作过程中始终保持无菌。本方案是根据参考文献为人肝脏类器官而优化的,其他组织的类器官可能有不同的培养要求。


1)   将 Cultrex RGF BME 置于冰上,在冰箱内解冻过夜。


2)   准备肝脏类器官初始培养基(表 2)、肝脏类器官扩增培养基(表 3)和肝脏类器官分化培养基(表 4):

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人肝细胞分离及类器官培养实验方案

1)   为了分离人胎肝细胞,应在肝脏回收后尽快处理新鲜材料。使用 0.9%(wt/vol)NaCl 溶液清洗肝组织,镜下观察,根据捐献者孕周的不同,肝实质内可见明显的白色树状结构。建议将其去除,以避免肝脏导管类器官的生长。


2)   吸出多余的液体,在人肝组织(0.5-1 cm3) 中加入 5 mL 新鲜配制的Ⅳ型胶原酶消化液消化(2-5 min,37℃ 孵育),期间使用镊子切碎至 2-5 mm,并进一步使用枪头吹匀,转移至 50 mL 离心管中加入 35 mL adDMEM/F12 洗液终止消化,低速离心(300-400 g、5 min、4℃)。


3)用冰预冷的 adDMEM/F12 培养基洗涤过滤多次,低速离心(300-400 g、5 min、4℃)。同时建议去除红细胞。


4)用 RGF BME 重悬细胞沉淀,并分装至各个孔中,在 24 孔板的每孔中央加入 50 μL Cultrex RGF BME/肝细胞混合物,以形成圆顶状包埋结构。

注:Cultrex BME 圆顶结构不应接触到孔壁。


5)将培养板放入细胞培养箱内,孵育 15 分钟,让 Cultrex RGF BME 聚合。


6)加入适当体积的肝脏类器官初始培养基(表 2),每孔大约需要 500 μL。


7)将含有肝脏类器官培养物的培养板放回细胞培养箱内,以促进类器官生长。


8)三天后从各孔中吸出培养基,每隔一天加入新鲜的肝脏类器官扩增培养基(表 3)。每孔大约需要 500 μL。

注:培养基应从各孔的角落中轻柔吸出或加入,避免接触到 Cultrex RGF BME/类器官,以防止其分散。


9)对类器官进行传代(详见本文后面肝脏类器官的传代章节)或在 7-10 天后开始分化。

注:前 2 代或 3 代培养物中可能存在基质细胞和非实质细胞。这些细胞通常在传代时逐渐丢失。有时,我们还观察到在细胞系建立过程中出现一些囊性导管样类器官,推测是肝导管细胞生长的结果(下图)。如果发生这种情况,应手动挑出这些囊性类器官,因为它们的存在会影响纯肝细胞类器官培养物的建立。一般认为一旦达到第 5 代,已成功建立肝细胞类器官系 [2]。


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肝脏类器官的分化

1)在扩增 7-10 天后,吸出肝脏类器官扩增培养基,用 PBS 清洗一次,然后加入同样体积的肝脏类器官分化培养基(表 3)。每孔大约需要 500 μL。接着孵育 11-13 天。


2)每隔一天从各孔中吸出培养基,然后加入新鲜的肝脏类器官分化培养基。

注:培养基应从各孔的角落中轻柔吸出或加入,避免接触到 Cultrex RGF BME/类器官,以防止其分散。


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未分化(左)和分化(右)的人肝脏类器官(显微镜明场图像)


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对分化的人肝脏类器官进行鉴定。图中显示了分化肝脏的显微镜荧光图像,这些类器官表达分化的肝细胞所特有的蛋白质,包括 Cytokeratin 19(R&D Systems,货号AF3506)、HNF3-beta(R&D Systems,货号 AF2400)和 Albumin(R&D Systems,货号 MAB1455)。利用 DAPI(Tocris,货号 5748)对类器官进行复染。


肝脏类器官的传代

1)在显微镜下观察肝脏类器官。为了确保最佳生长,每个孔应包含约 500 个类器官。快速生长的类器官培养物在传代时可平分成 4 份,但缓慢生长的培养物最好平分成 2 份。在收集类器官之前确定该平分比例,以便在实验开始前估计试剂的用量。


2)将含有肝脏类器官的 24 孔板从细胞培养箱转移至超净工作台。


3)从孔的底部吸出培养基,而不扰动类器官。


4)用 10 倍体积的预冷(2-8°C)PBS 清洗每孔(表 5)。


5)吸出 PBS,向每孔中加入 10 倍体积的预冷(2-8°C)Cultrex 类器官收获液(表 5)。

6)将培养板置于 2-8°C 或冰上,孵育 30-90 分钟,并轻轻振摇。当各孔底部的基底膜基质圆顶结构不再可见,并且类器官漂浮在各孔底部时,孵育过程结束。

注:用细胞刮刀或移液管刮动圆顶结构,可能会加速此过程。


7)在基质解聚后,将各孔的内容物转移到置于冰上的管中。单个孔可转移至微量离心管中,而多个圆顶结构可能需要 15 mL 或 50 mL 锥形管。


8)将管放入离心机内,在 2-8°C 下以 500xg 离心 5 分钟,沉淀类器官。弃去上清液。


9)用 10 倍体积的预冷(2-8°C)PBS 清洗类器官,再次在 2-8°C 下以 500xg 离心 5 分钟,沉淀类器官。弃去 PBS。加入新鲜、冰预冷的肝脏类器官扩增培养基。


10)用血清移液管上下吹打三次,混合类器官。


11)在室温下以   500×g 离心 3 分钟。


12)弃去培养基,小心不要扰动类器官沉淀。


13)用 Cultrex RGF BME 重悬类器官,在 24 孔板的每孔中央加入 50 μL 混合物,以便形成圆顶状结构。按照传代方案第 1 步所建议的密度和平分比例进行操作。

注:包含 Cultrex RGF BME 的类器官不应接触到孔壁。


14)将培养板放入细胞培养箱内,孵育 15 分钟,让 Cultrex RGF BME 聚合。


15)在每孔中加入 500 μL 肝脏类器官初始培养基。


16)将含有类器官培养物的培养板放回细胞培养箱内,以促进类器官生长。按照肝脏类器官的扩增方案进行操作。

参考文献:

1. Meritxell Huch , et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015 Jan 15;160(1-2):299-312.

2. Delilah Hendriks ,et al. Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR-Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver. Nat Protoc. 2021 Jan;16(1):182-217.


文章分类: 技术前沿