凝血因子FVIII相关的蛋白活性缺失会导致A型血友病。患者会发生自发或创伤导致的出血，造成疼痛、关节病，甚至出现颅内出血等严重危及生命的并发症。目前针对A型血友病的常见治疗方式主要是通过长期服用外源性的FVIII，或进行预防性给药，达到对疾病的控制作用，于此同时，研究人员针对A型血友病的基因治疗也在研发中。目前，一款名为valoctocogene oxaparvovec的基因疗法，是一种将B结构域删除的人F8基因（hFVIII-SQ）与肝脏选择性启动子（HLP）包装在AAV5型载体中（AAV5- hFVIII-SQ），用于长期管理严重A型血友病（FVIII<1 IU dl-1）的治疗方法。但对于使用基因疗法的患者进行随访过程中，药物本身在体内分布的临床数据是较难获得的。
2022年4月，BioMarin Pharmaceutical的研究人员在Nature Medicine上发表了一篇题为Interindividual variability in transgene mRNA and protein production following adeno-associated virus gene therapy for hemophilia A的文章，对参与A型血友病基因治疗的其中5位参与者（取得同意后）进行了肝脏样本活检，监测使用基因药物后对肝脏组织学等是否有明显影响（NCT02576795）。在该项研究中对于肝脏中基因治疗载体以及所转录的FVIII RNA，使用了RNAscope的方法进行原位检测。
5位参与者在活检前接受了不同剂量的载体药物注射。5位参与者编号分别为1、11、15、3、4，分别接受的药物剂量为6*1012 vg/kg bw（viral genome per kg body weight）（参与者1）、4*1013 vg/kg bw（参与者11、15）和6*1013 vg/kg bw（参与者3、4）。（表1）
研究人员对5位参与者的肝脏组织分别进行了H&E染色，结果显示肝脏均未发现明显的坏死、纤维化、异常增生等现象。随后使用美国Bio-Techne公司旗下ACD公司的RNAscope的方法对5位参与者肝脏的不同肝叶肝细胞中AAV5- hFVIII-SQ载体DNA进行检测，发现在不同肝叶中，基因治疗药物DNA载体的分布量与最初接受的药物注射量成正相关关系，且在肝脏的不同叶中均有分布（图1）。RNAscope技术之所以可以广泛应用于这类研究中，主要是其既可以针对基因治疗载体本身区域进行探针设计，原位检测携带治疗基因进入体内后的载体的分布，又可以针对携带的治疗基因设计探针，检测治疗基因的原位转录和分布情况。正是借助这些优势，本文在活检样本既检测了基因治疗载体DNA的分布，也检测了治疗基因在不同接受治疗病人肝脏内的转录分布情况。
图1. RNAscope法检测参与者肝脏组织中原位检测AAV5- hFVIII-SQ载体DNA（图中棕色信号点）。
相对而言，参与者15对于药物的应答性较低，但原位检测结果显示，其药物在肝细胞中阳性率仅略低于同剂量药物组的参与者11（图2）。
图2. AAV5- hFVIII-SQ DNA在参与者肝脏样本内阳性细胞计数占比，右图中的棕色信号点位RNAscope发检测到的AAV5- hFVIII-SQ载体DNA。
随后，研究人员比较了5位参与者组织内FVIII-SQ基因RNA的表达量，并根据内参基因进行了标准化。结果显示，5位参与者的FVIII-SQ RNA表达量整体趋势与给药剂量成正相关，但对于对药物应答性弱的参与者15号与同等给药剂量的参与者11号相比，其FVIII-SQ RNA的表达量低于药物应答者近10倍（图3）。
图3. RNAscope法原位检测FVIII-SQ RNA，左图中红色信号点位RNA信号点。
研究人员通过分析RNA及蛋白合成相关因子，推测肝细胞中内质网特异性分子标记物GRP78可能是与FVIII-SQ活性蛋白的合成有关，最终影响到试验参与者对基因治疗药物的应答程度。
本文利用Bio-Techne旗下ACD公司的新一代RNA原位杂交检测法RNAscope方法，在临床试验的参与者组织样本中对基因治疗所使用的载体DNA及转录的RNA进行了原位检测及定量分析，对不同参与者用药后产生的应答差异进行了原因探究，为后续基因治疗药物效果的改善与提高提供了重要参考。
RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下：
使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。
RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。
RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。
使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。
由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。
RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。
由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。
在RNAscope技术的基础上，ACD公司旗下的Basescope技术可以检测RNA水平的外显子跳跃，点突变，环状RNA等；miRNAscope可以原位对小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO进行追踪定位；而近年来推出的RNAscope HiPlex技术则可以在一张石蜡切片上同时检测最多12个RNA靶标的分布定位，成为神经科学，肿瘤微环境研究以及单细胞测序后验证等领域的常用检测方法。
1.Nature Medicine volume 28, pages789–797 (2022) Interindividual variability in transgene mRNA and protein production following adeno-associated virus gene therapy for hemophilia A
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