单细胞分辨率RNA分子检测助力免疫交互模型结果验证来源：RNAscope
人类免疫系统由分布在全身的细胞网络组成。这些细胞需要通过细胞表面蛋白质组之间的动态相互作用形成物理联系和通信。随着对免疫系统的了解加深，越来越多的发现证实它们可以作为很多疾病的治疗靶点，具有巨大的潜力。但免疫细胞之间相互作用的图谱还未完全被挖掘发现。2022年8月3日，来自剑桥大学、苏黎世联邦理工学院等多家单位的研究人员在Nature 上发表了文章“A physical wiring diagram for the human immune system”，采用高通量受体筛选、文库构建、单细胞验证等多种方法，构建了数学模型，预测细胞连接和相互作用关系，推测全身免疫相互作用。 作者根据不同受体的结构，构建了表达载体和重组蛋白结构，建立SAVEXIS方法筛选不同结构类型的细胞表面蛋白。根据筛选的结果，作者构建了一个详细的包含外周免疫细胞表面蛋白和重组表达蛋白的文库，通过对文库的生信分析及纯化、筛选、重复测试，作者确定了28种新的免疫相关分子相互作用（图1）。这其中值得注意的是，新发现的分子相互作用包括孤儿免疫检查点受体VISTA的内源性非肿瘤配体。  图1. 免疫受体相互作用网络示意图。红色代表新发现的相互作用。 随后，作者又对受体蛋白之间相互作用的参与度进行了量化与评估。由于初始分析均是基于循环免疫细胞，而免疫系统在各个器官中广泛存在且会根据机体情况发生动态变化，因此作者之后也对部分组织器官内免疫细胞与组织细胞可能的交互进行了分析。根据单细胞数据和基因表达细胞本身的物理连接性质，作者绘制了不同器官内大量免疫细胞之间的交互关系。  图2. 不同组织器官内免疫细胞间的交互关系。 作者之后选择人类淋巴结的空间转录组数据和单细胞RNA原位检测的方式，对前述的分析结果进行了进一步验证。空间转录组证实受体和配体的空间共定位情况，而为了更精确地看到单个细胞中受体和配体的表达情况，作者使用了RNAscope的方法，对部分靶标进行了单细胞分辨率水平的标记和验证。作者选取了分析鉴别出的新型相互作用对，如JAG1-VASN，确认它们分布在人类淋巴结免疫细胞丰富的隔间边缘区域，这说明其相互作用在体内免疫细胞之间确有可能发生（图3）。  图3. 使用RNAscope，在人淋巴结样本中鉴定新型免疫细胞配体-受体交互作用。 免疫系统是比较独特的生理系统，它并不是固定于体内某个局部器官内，而是随着机体的状态发生动态变化。细胞之间需要适应相互作用和连接，以应对病原体和其他威胁。作者希望能够借助此工作建立的方法，在日后的研究中能够更深入的分析了解不同个体、不同状态下免疫细胞的作用，帮助疾病治疗寻找潜在合适的靶点。
RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下： 应用广泛 使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。 特异性强 RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。 灵敏度高 RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。 单分子可视化和单细胞定量 使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。 兼容降解的RNA 由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。 检测结果稳定一致性 RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。 多通道多靶点同时检测 由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。 在RNAscope技术的基础上，ACD公司旗下的Basescope技术可以检测RNA水平的外显子跳跃，点突变，环状RNA等；miRNAscope可以原位对小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO进行追踪定位；而近年来推出的RNAscope HiPlex技术则可以在一张石蜡切片上同时检测最多12个RNA靶标的分布定位，成为神经科学，肿瘤微环境研究以及单细胞测序后验证等领域的常用检测方法。
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