MMCA®多色熔解曲线分析技术在分枝杆菌病分子病理诊断的应用

表1 肺肉芽肿性疾病的疾病谱

结核病（Tuberculosis,TB）是全球十大死因之一，也是单一感染原的主要死因^[2]。

非结核分枝杆菌病（NTM病）感染率及发病率均呈上升趋势。多数NTM病患者对传统抗结核药物耐药，容易误诊为结核病。因此，NTM病的精准诊断，对制定治疗方案尤为重要^[3]。

病理学诊断是微生物学之外最重要的结核病确诊途径，尤其在痰菌阴性的肺结核及肺外结核的诊断中发挥着非常重要的作用。

目前可应用于临床的结核病病理学诊断方法主要包括形态学诊断（HE染色）、特殊染色（抗酸染色及真菌染色等）及分子病理基因检测等（图1）。

图1 结核病病理学诊断推荐流程图

1、手术切除标本   

2、内镜活检、穿刺活检和细针吸取的小标本

标本制作：标本组织经固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片。标本制作完成后再进行括形态学诊断（HE染色）、特殊染色（抗酸染色及真菌染色等）及分子病理基因检测。

1、常规病理学检测：常规病理标本的诊断包括大体检查和HE染色，该方法不能区分肉芽肿疾病之间的鉴别诊断，且不能区分结核病与非结核分枝杆菌病。

2、特殊染色：特殊染色分为抗酸染色、网状纤维染色、六胺银及过碘酸盐希夫染色、金安罗丹明染色，其中抗酸染色是诊断结核病最常用的特殊染色方法，但是该方法并不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

3、免疫组织化学染色：免疫组织化学法是利用抗原-抗体的特异性结合反应原理，以抗原或抗体检测和定位组织中目标蛋白质的一种技术方法。该方法具有还没有可以应用于临床的成熟试剂，且存在无法分辨结核病与非结核分枝杆菌病的不足。

图2 以肺组织样本为代表的组织学特征^{[4, 5]}

注：HE染色（A），结核性肉芽肿伴干酪样坏死；抗酸染色（B），黑色箭头显示阳性细菌；免疫组织化学法 MaxVision法（C）。

随着分子生物学技术的快速发展，结核病病理学诊断可以为临床提供更为精准、明确的诊断，特别是结核病与非结核分枝杆菌病的鉴别诊断，耐药结核病的突变位点检测等^[6]。

2017年发布的《中国结核病病理学诊断专家共识》提出病理学确诊结核病必须同时满足两个条件^[7]：(1)组织形态学符合结核病病理基本变化；(2)通过分子病理学检测获得明确的病原学依据。2020年发布的《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南》建议分子生物学检测结果可作为NTM肺病、肺外NTM病和播散性NTM病的确诊依据^[8]。

近年来，分子病理学诊断技术在结核病和非结核分枝杆菌病的诊断和鉴别诊断的作用越来越重要。

致善生物拥有FFPE样本前处理试剂、核酸提取纯化试剂、结核分枝杆菌复合群核酸检测*、分枝杆菌鉴定*、利福平*、异烟肼*、氟喹诺酮类*、乙胺丁醇*、链霉素*、吡嗪酰胺、二线注射药等检测试剂，可用于辅助快速精准诊断结核病，及时发现MTBC感染、利福平耐药结核（RR-TB）、异烟肼耐药结核（Hr-TB）、MDR-TB、pre-XDR-TB、非结核分枝杆菌（NTM）病等不同类型患者，提升精准治疗水平，助力提高基层结核病定点医疗机构、综合医院的结核病及NTM病的诊断能力，对结核病防控等具有重要意义！

传统去除石蜡采用二甲苯脱蜡法，该方法具有毒性，且会损害DNA。而致善生物采用一步脱蜡法，具有无毒无害，提取效率高，得率高的特点。并且适配结核全系列试剂，与临床结果符合度较高。

图3 石蜡包埋样本提取流程

致善生物结核分枝杆菌复合群核酸检测基于荧光定量PCR法，检测结核分枝杆菌特异的IS6110基因，可对结核分枝杆菌复合群进行快速检测，有研究报道结核分枝杆菌复合群核酸检测痰液样本阳性率高于MGIT960培养法，将其应用于结核病的诊断，显著提高了MTB的阳性检出率^[9]。

致善生物分枝杆菌鉴定试剂盒是国内首个基于荧光PCR平台的菌种鉴定产品，目前分枝杆菌鉴定已被应用于不同标本类型的菌种鉴定科学研究，包括疑似NTM临床分离株样本^[10]、疑似MDR-TB临床分离株样本^[11]、痰样本^[12]、组织切片样本^[13]。分枝杆菌菌种鉴定在浅表淋巴结石蜡包埋样本检测中能明显提高诊断阳性率^[13]，在肺部石蜡包埋样本检测与培养法有较好的一致性^[3]，并且在非结核肉芽肿病变的石蜡包埋样本，具有较为理想的敏感性和特异性^[14]，具有良好的临床应用前景。

致善生物结核耐药检测具有快速、敏感的特点，被越来越多地应用于结核病耐药基因检测可以更快的诊断耐药结核病，缩短患者治疗等待时间。有研究报道，熔解曲线法在淋巴结核组织样本中利福平、异烟肼和左氧氟沙星符合率均达到95%以上^[15]，在颈部淋巴结石蜡包埋标本中对利福平、异烟肼进行耐药性研究，灵敏度和特异度较高，可为颈部淋巴结核的正确诊断与合理化治疗提供依据^[16]。在结核性脓胸脓液和病灶组织样本检测上，耐药检出率与MGIT 960表型药敏试验相近，可快速检测耐药性^[17]。并且有文献指出，熔解曲线法在疑似骨结核患者检测结核利福平耐药的敏感度和特异度为80%和100%，可应用于骨结核耐药检测^[18]。

致善生物拥有适配多色熔解曲线法的两大诊断平台，分别是MeltPro^®分体式检测系统和Sanity^® 2.0全自动PCR分析系统。

MeltPro^® 系统：简便、快速、可靠地实现从核酸提取到核酸检测的全流程自动化、核酸检测数据软件自动分析后给出判读结果的智能化诊断。

Sanity^® 2.0一体机：只需一键操作，无需任何人工干预，真正实现“样本进，结果出”，减少对操作人员的要求，极大地缩短了诊断时间、提高了诊断效率。

Sanity^® 2.0是首个实现MTBC、耐多药（MDR）结核和准广泛耐药（pre-XDR）结核的一体化检测平台，可用于辅助快速精准诊断结核病，及时发现MTBC感染、利福平耐药结核（RR-TB）、异烟肼耐药结核（Hr-TB）、MDR-TB、pre-XDR-TB、非结核分枝杆菌（NTM）病等不同类型患者，及时、即时检测，助力分枝杆菌病及耐药结核病的快速精准诊断！

关于致善

致善生物多年来深耕于结核病分子诊断领域，拥有完全自主知识产权的多色熔解曲线分析技术（Multicolor Melting Curve Analysis，MMCA^®），推出了满足高通量检测需求的MeltPro^® TB一体化检测系统和灵活检测需求的Sanity^® 2.0全自动医用PCR分析系统两大检测平台。作为国内结核病分子诊断全程解决方案的引领者，致善生物已推出涵盖结核筛查*、分枝杆菌鉴定*、分子药敏*、个体化用药指导、菌种溯源等全方位检测的产品矩阵。