RNAscope 助力细胞治疗在实体瘤中的应用
靶向新抗原的过继性T细胞治疗是一种有前途的新治疗技术，其在部分血液瘤中已取得了较好的疗效，但对于实体瘤，由于免疫微环境的复杂作用，以及缺乏共同的抗原表位，一定程度上限制了该技术的疗效。2022年8月，来自宾夕法尼亚大学和Immatics Biotechnologies的研究人员在Science Translational Medicine上发表的题为“Quantitative immunopeptidomics reveals a tumor stroma–specific target for T cell therapy “的文章，鉴定了一个共同的泛癌胶原VI型α-3（COL6A3）表位，该表位存在于肿瘤基质上，是选择性剪接的结果。他们构建了亲和力增强的T细胞受体T（TCR-T）细胞，并对小鼠进行在体治疗，结果显示表达靶向pHLA的肿瘤的消退，而对正常细胞没有毒性。 pHLA复合物在肿瘤上高度表达，而在健康组织上几乎不表达，在进行TCR-T方式进行治疗时，能够准确识别pHLA，引导T细胞对肿瘤而非健康组织进行特异性杀伤，是对以TCR为基础的细胞治疗安全性和有效性的关键要求。作者使用了群体规模免疫肽组学、定量质谱，在约1500个肿瘤和正常的组织样本中鉴定了COL6A3基因内的HLA-A*02:01限制性泛癌表位。作者用HLA-A*02特异性抗体进行免疫沉淀后，分析了来自HLA-A*02阳性的739个肿瘤和673个正常组织样品中的HLA-A*02-presented peptides，确认了来自COL6A3外显子6（COL6A3-E6）的肽（COL6A3-FLNV）在约28%的肿瘤样本中有表达，而在正常组织中，仅约有1%的样本有表达（图1）。  图1. 肿瘤（红色）和正常样品（蓝色）中分离HLA结合的COL6A3-FLNV肽的相对丰度。 作者结合TCGA数据库，结合本研究的数据，用以估计COL6A3-FLNV在几种肿瘤类型中的目标患病率。数据表明COL6A3-E6的表达在肿瘤中高度富集，这导致了普遍的泛癌表位的出现。随后，作者利用RNAscope的方式，使用COL6A3-E6、panCK（泛细胞角蛋白）、ACTA2（平滑肌肌动蛋白α2）等探针，对患者的肿瘤组织连续切片进行RNA原位检测，以了解COL6A3-E6在肿瘤组织中表达的空间位置。连续切片上的显色染色显示COL6A3-E6表达与ACTA2表达明显共定位（图2）。ACTA2阳性区域代表肿瘤基质区域。
图2. COL6A3-E6在肿瘤组织切片中的空间定位，panCK作为肿瘤区域定位标志，ACTA2作为肿瘤基质区域标志。 随后，作者筛选出了高亲和力的COL6A3特异性TCR，能够使T细胞对pHLA能够特异并灵敏的识别，并在小鼠中做体内实验。实验结果表明，表达亲和力增强的COL6A3特异性TCR的T细胞在体内能够特异性地控制肿瘤。 确定肿瘤选择性靶点是开发特异性免疫疗法的关键。这篇文章中，作者通过定量LC-MS/MS，使用群体规模免疫肽组学，对肿瘤和正常组织上差异表达肽进行无偏见的搜索。在COL6A3的选择性剪接外显子中鉴定了HLA-A2限制性肿瘤间质表位COL6A3-FLNV，该表位在肿瘤间质上以高拷贝数呈现，并由不同肿瘤类型的许多患者共享。作为TME的关键组成部分，肿瘤基质已被证明在肿瘤发生、发展和转移中起着重要作用，其破坏可导致肿瘤消除。文章中利用RNAscope证实了COL6A3-FLNV特异性在肿瘤基质中表达，为TCR-T针对基质对肿瘤实现杀伤提供了一个良好的靶点。 RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下： 应用广泛 使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。 特异性强 RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。 灵敏度高 RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。 单分子可视化和单细胞定量 使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。 兼容降解的RNA 由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。 检测结果稳定一致性 RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。 多通道多靶点同时检测 由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。 在RNAscope技术的基础上，ACD公司旗下的Basescope技术可以检测RNA水平的外显子跳跃，点突变，环状RNA等；miRNAscope可以原位对小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO进行追踪定位；而近年来推出的RNAscope HiPlex技术则可以在一张石蜡切片上同时检测最多12个RNA靶标的分布定位，成为神经科学，肿瘤微环境研究以及单细胞测序后验证等领域的常用检测方法。 四川爱德科技有限公司成立于2003年，是专业销售生命科学、生物研究、医疗防疫检测用试剂、耗材和设备的高科技公司。本着智慧成就梦想，诚信缔造未来的理念，公司致力于为人类健康事业提供研究及诊疗专业解决方案，为全球客户提供卓越的产品和服务。
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