荧光底物检测酶活:其实没你想的那么难!

图片

目前用来检测酶活性的实验方法有很多,比如分光光度法、荧光法、放射性标记法等。今天,技术支持 Shirley 与你聊一聊如何使用荧光底物测定酶活。

图片

在查看酶类产品参数时,很多小伙伴一定见过这样的描述:The specific activity is >X pmol/min/µg,我们以 R&D Systems®的产品 Recombinant Mouse ACE- 2 Protein(货号 3437 -ZN)为例,在产品详情的 Activity 一栏,明确说明了此产品的活性使用荧光底物 Mca-YVADAPK(Dnp)-OH(货号 ES007)测定,按照提供的方法测得的活性为>400 pmol/min/µg:

图片

测试的材料方法也提供在产品详情页面,如下图:

图片

为了方便理解,我们通过公式反推计算酶活需要的数据。产品的酶活就是由红框中的计算公式得出,乍一看很复杂,别急,我们来拆分一下。公式由三部分组成:调整后的最大反应速率(Adjusted Vmax),单位是 RFU/min;使用和荧光底物相同的荧光标准品绘制标曲的斜率作为转换系数(Conversion Factor),单位是 pmol/RFU;体系中酶的含量,单位是 μg。

首先是 Adjusted Vmax,使用荧光读板仪,例如 SpectraMax Gemini EM by Molecular Devices,设置好荧光底物对应的激发光和发射光波长,使用「kinetic mode」读板 5 分钟,由于酶促反应较为迅速,可以将读板间隔时间设置短一些,如 10 秒左右,就像 3437 -ZN 在测试时的读取结果:


图片


以时间(second)作为横坐标,以平均荧光值(RFU)作为纵坐标绘制一条直线,这条直线的斜率即为 Vmax,单位为 RFU/Second,×60 转换为 RFU/min。需要注意的是,这样得出的 Vamx 并没有考虑背景值,因此,需要减去背景值得到「Adjusted Vmax」,即 Adjusted Vmax = Vmax–Vmax Substrate Control。

转换系数的计算需要使用和底物被酶切割后释放的荧光基团一致的荧光标准品制作一条标曲,例如上述测定 3437-ZN 活性时使用的 MCA(MCA-Pro-Leu-OH, Bachem, Catalog # M-1975),可以选取 0~200 pmol 这个范围梯度稀释绘制标曲,在仪器上同样设置 MCA 的激发光和发射光波长(320 nm/ 405 nm),荧光值作为纵坐标(y 轴),荧光标准品的用量作为横坐标(x 轴),绘制一条 y= mx+b 的标曲,其中,1/m 即为 Conversion Factor,单位 pmol/RFU。

第三部分酶的用量无需赘述,填入实验体系中酶的添加量即可,单位 μg。

怎么样,经过解析,你学会了如何使用荧光底物计算手里的酶的活性了吗?

图片

四川爱德科技有限公司

四川爱德科技有限公司成立于2003年,是专业销售生命科学、生物研究、医疗防疫检测用试剂、耗材和设备的高科技公司。本着智慧成就梦想,诚信缔造未来的理念,公司致力于为人类健康事业提供研究及诊疗专业解决方案,为全球客户提供卓越的产品和服务。
爱德在发展过程中已逐步成为国内外知名品牌的战略合作伙伴。先后与全球知名医疗行业公司:Roche、Beckman、Illumina、PerkinElmer、Luminex、Promega、SIGMA、Bio-Techne、赛多利斯、达安基因、义翘神州、力康、中元汇吉、睿科生化、若斌生物等品牌建立了长期的友好合作关系。
公司的客户主要涉及临床系统、疾控系统、公安系统、科研院所、商检系统、环保系统、生物制药企业、体外诊断试剂生产厂家、疫苗生产企业等。公司不仅在同行业中取得了骄人的成绩,也赢得了广大客户的信任与拥护。

图片

文章分类: 技术前沿精选文章