RNAscope Hiplex 结合免疫组化，实现对神经元胞体区域的准确识别和定量分析来源：RNAscope
 研究人员将整个SCAMPR分为两大部分：（1）进行实验和图像预处理步骤，（2）通过开源图像处理工具对图像进行自动分割和分析（图1）。在实验部分，研究人员先利用RNAscope Hiplex技术，在样本上进行12个靶标RNA的标记，同时完成RNA原位图像采集工作，随后又使用蛋白染色的方法，对神经元内HuC/HuD进行染色。HuC和HuD是参与转录调节的mRNA结合蛋白，在胚胎发育开始的神经元中选择性表达，最初出现在祖细胞中，直到成年后继续在有丝分裂后神经元中表达。HuC/D的全细胞表达、神经元特异性和广泛的表达时间过程使其成为需要神经元分割的定量研究的优秀细胞边界标记。随后对细胞识别算法进行了优化，根据HuC/D的轮廓引导，更准确地识别单个细胞的细胞边界，实现在同一张切片上对神经元内RNA信号进行更准确地定量分析。 
图1. SCAMPR实验流程。 研究人员先测试了在RNAscope Hiplex后蛋白染色的可行性。实验结果证实，多轮RNAscope HiPlex可成功应用于出生后第9天（P9）外周神经系统的结状神经节（NG）以及成年中枢神经系统的V1区域（图2A、2B、2E和2F）。随后的HuC/D免疫染色与这些相同组织中的RNAscope HiPlex兼容，并在多轮RNAscope HiPlex后准确标记神经元细胞体（图2C和G）。HuC/D标记与核DAPI标记的比较表明，HuC/D比核DAPI信号更精确地捕获完整的单个细胞轮廓，从而可以对两种组织中单细胞RNAscope信号进行更精确的定位（图2C、2D、2G和2H）。  图2. 结合IHC和RNAscope HiPlex，可以在中枢和外周神经系统中实现高分辨率的单细胞mRNA表达。 空间转录组学数据的定量分析需要将细胞分割成单个离散单元。组织切片中最精确的细胞分割将通过更精确的细胞边界标记来获得。DAPI可以标记细胞核，但由于mRNA在细胞核和细胞质中均有可能存在，那么基于细胞核的分割可能导致mRNA荧光信号未计算完全，因此只能做大致估计和定量。而如果结合免疫组化对胞浆或胞质的蛋白进行标记，则能够帮助较好的识别出单个细胞的轮廓。研究人员使用两个基因的定位，随后手动分割，证明在V1的样本中，使用DAPI信号的核分割和使用HiPlex RNAscope后HuC/D染色的全细胞分割之间，mRNA信号检测存在差异（图3A）。与DAPI信号相比，HuC/D信号允许分割细胞体，并更准确地包围分割细胞中的全部mRNA信号（此处为Pvalb和Chd13）（图3B）。此外，研究人员还对开源图像分割程序进行了优化，使其能够更完整、更准确地识别出细胞，相比于对细胞进行手动分割，优化后的自动分割可以自动识别的又快又好（图3C、D）。
图3. 使用优化的Cellpose根据免疫组化结果对细胞进行自动化分割。 根据SCAMPR方法，可以实现在单细胞水平上对多个mRNA的荧光定量分析，同时根据图像提供的空间信息，也可进一步研究感兴趣基因和细胞之间潜在的相互关系。研究人员根据Hiplex提供的单细胞RNA原位信息，可以看到不同基因在V1不同层结构中的表达强度与偏好（图4左）。再对信号数量进行标准化与局部加权回归，可得到在拓扑结构内不同基因之间的相对表达强度（图4右）。在发育及很多疾病过程中，基因之间表达的相对变化都有其特殊的意义，在某些情况下，对于发育或疾病发展过程甚至是十分重要的。
图4. Met与Slc17a7在小鼠V1区域神经元中的表达强度，以及二者之间的相对表达量。 在本篇研究工作中，研究人员结合了RNAscope Hiplex与免疫组化的方法，对于感兴趣的细胞进行了更准确的标记，为后续的分析工作奠定了较好的基础，同时RNAscope可达到的单细胞水平分辨率，为部分低丰度靶标、特异性表达的靶标的原位检测提供了一个良好的平台。 RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下： 应用广泛 使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。 特异性强 RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。 灵敏度高 RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。 单分子可视化和单细胞定量 使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。 兼容降解的RNA 由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。 检测结果稳定一致性 RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。 多通道多靶点同时检测 由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。 在RNAscope技术的基础上，ACD公司旗下的Basescope技术可以检测RNA水平的外显子跳跃，点突变，环状RNA等；miRNAscope可以原位对小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO进行追踪定位；而近年来推出的RNAscope HiPlex技术则可以在一张石蜡切片上同时检测最多12个RNA靶标的分布定位，成为神经科学，肿瘤微环境研究以及单细胞测序后验证等领域的常用检测方法。
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